今天,就給大家嘮嘮色譜柱為何“暴斃”,為什么它會“想不開”。
液相色譜柱
首先我們知道,每一根色譜柱都有一個大致的進樣針數(shù)壽命,理論上可以有一個規(guī)定,達到進樣多少針,就強制報廢。但事實上好像又并沒有這樣的規(guī)定,那么我們也可以作為一個參考,當色譜柱的柱性能參數(shù)(就是常說的理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子等等)不達標時,參照進樣針數(shù)判斷是柱子壽命到了,屬于不可逆因素,只能換柱子。
而其它原因,如流動相配制錯誤,或者流動相變質(zhì)了,也可能稀釋液強度太大,也可能是方法就是錯的,也可能是樣品本身問題。
不過色譜柱的累積性損壞自然不是一朝一夕的事,柱性能是緩慢下降的,但是沒有一個特定的標準,要看具體的分析方法,而且跟柱型號也有關(guān)系。
常規(guī)的分析方法下C18柱壽命是很長的,因為C18柱是目前技術(shù)最先進,質(zhì)量最可靠,使用最廣泛的色譜柱,在常規(guī)分析方法下,基本上不會損壞。但是如果流動相比較特殊,如高鹽、高pH>8、低pH<1、高柱溫、高比例水相、高比例有機相等等,色譜柱的損壞就會相應地加劇。
這些可以算作是化學損傷,如果是操作不當,例如,流動相和樣品溶液沒有過濾,或者撞擊色譜柱等,也會造成物理損傷,也會嚴重影響色譜柱壽命,甚至是遺言都沒來得及留下,“一招斃命”。
前面提到了柱型號,不同型號的色譜柱壽命當然也不一樣,跟前面說到的C18類似的,CN柱、苯基柱等鍵合硅膠柱都具有較長的使用壽命。不過所有基于硅膠基質(zhì)的色譜柱都有一個天生的弱點,就是硅膠是能被水溶解的,雖然溶解度很小,但是長年累月使用,尤其在反相色譜系統(tǒng)中,累加了高鹽、高pH、高柱溫、高比例水相等方法參數(shù)后,硅膠的流失尤為明顯。
曾經(jīng)做過一個項目,流動相含鹽,柱溫高達50度,基本上一根色譜柱半年就報廢了。不過,是有一種方法可以解決這個問題的,就是在色譜柱前加一個柱芯與色譜柱類型相同的預柱,也叫保護柱,當流動相里溶解預柱里的硅膠飽和以后,就不再侵蝕色譜柱的硅膠,從而大大延長色譜柱壽命。
不過不到萬不得已還是不要使用特別苛刻的流動相,要知道預柱的柱芯也是很貴的,那就是一根較短的色譜柱啊,就算保住了色譜柱,經(jīng)常換柱芯也是吃不消的。
但是,有一些類型的色譜柱,天生就是短命鬼,例如NH2柱,有時候好不容易平衡好系統(tǒng),進個幾十針樣就OVER了,像是一次性的。就像焰火,它華麗的現(xiàn)身,轉(zhuǎn)瞬就湮滅了。這些就留待色譜柱專家們?nèi)ラ_發(fā)更加穩(wěn)定可靠的新填料了。
還有一類柱子,手性分離柱,這在醫(yī)藥行業(yè)是很大的一個應用。通常手性色譜柱是正相柱,這就要求我們在使用手性柱之前要先把系統(tǒng)置換干凈,再接上柱子用流動相沖洗平衡進樣。
通常是甲醇、異丙醇、正已烷+異丙醇、流動相這樣的順序,如果忘記這個過程,會造成很大的麻煩。而且有一些手性柱是涂敷柱,例如淀粉、纖維素等大分子涂敷柱非常怕水,如果系統(tǒng)中原來的反相流動相沒有置換干凈,就會對色譜柱造成不可逆損傷,甚至報廢。
近年來,科學家也開發(fā)出了鍵合的手性柱,相比較要穩(wěn)定的多,甚至也可以應用反相色譜系統(tǒng)。
使用后對色譜柱的沖洗保存也比較重要,使用了緩沖系統(tǒng)的尤其要注意。這里推薦一個反相色譜系統(tǒng)的通用沖洗流程:將所有通道置換成含有較低有機相比例的水相中,比如10-30%乙腈或甲醇,然后沖洗1個小時,然后再梯度增加有機相比例,各沖洗一定時間,最終保留在高有機相比例的沖洗液里。
低有機相比例的沖洗液是為了盡可能地沖洗緩沖鹽。
通常低壓梯度洗脫的液相色譜儀采用的是四元泵,就是單泵四通道,比例閥混合。這種混合方式有個弊端,就是混合效果差,因為各通道不同比例是通過開關(guān)各通道閥的時間來控制的。
打比方乙腈:緩沖鹽=50:50,如果流速是1.0mL/min,并不是說乙腈和緩沖鹽以各0.5mL/min的流速來混合;而是流速一直是1.0mL/min,但是在往復泵一個來回的時間內(nèi),兩個通道分別打開一半的時間,也就是說系統(tǒng)管道里是一段乙腈、一段緩沖鹽。這樣就會造成鹽的析出。
所以,往往是兩通道混合,就算沒有用緩沖鹽,還是建議先按比例混合好了,然后走單通道,否則的話一樣會造成鹽析出,或者基線波動。走梯度洗脫的話,往往會把有機相通道(B)中加入一定比例的水,或者把水相通道(A)配成梯度洗脫的初始比例,把有機相通道(B)配成梯度洗脫最終的比例。
有兩點需要說明:
(1)一般認為,色譜系統(tǒng)包括色譜柱的沖洗甚至保存,都可以使用流動相,只是不加緩沖鹽、酸堿等。例如上面提到的乙腈:緩沖鹽=50:50,做完樣品以后,就可以用50%乙腈/水來沖洗保存。有一些品牌色譜柱,例如資生堂,建議如果不是含鹽或者強酸強堿,一般不建議沖洗。不過這只適合短期保存,也就是沒隔多久又要再次使用。長期不用的色譜系統(tǒng)包括色譜柱還是應該沖洗后保存在高比例低極性溶劑體系中。一般建議正相系統(tǒng)保存在正已烷:異丙醇=90:10,反相系統(tǒng)保存在乙腈:水=90:10或者100%乙腈中。
(2)隨著快速分離色譜柱的發(fā)展,很多的低粒徑色譜柱得到應用,而且往往柱溫也較高,通常達到50度或以上,這種色譜系統(tǒng)通常柱壓也較高,貿(mào)然用高比例水相沖洗可能會導致系統(tǒng)超壓。可以先用流動相沖洗,或者斷開色譜柱,用高比例水相沖洗系統(tǒng),再接上柱子逐步提高有機相比例沖洗,也可以先調(diào)低流速沖洗。而且,最好待沖洗快要結(jié)束時再降低柱溫。
氣相色譜柱
下面說說歷史悠久的氣相色譜柱,現(xiàn)如今填充柱幾乎退出了歷史,人們說起氣相色譜柱自然就是石英毛細管柱。
相比較液相色譜柱,感覺氣相柱要簡單的多,而且,往往氣相柱各型號之間的專屬也不那么強,往往一個樣品用多種色譜柱分析,通過調(diào)整溫度程序,也可以得到相類似的分析結(jié)果。
常規(guī)的氣相色譜柱通常是石英管表面涂敷的液體填料,所以一般情況下,氣相色譜的分離其實是氣化后的樣品在液體填料里的溶解再揮發(fā)的性質(zhì)不同來實現(xiàn)的。那么既然填料是液體,自然就會揮發(fā)了,氣相色譜柱的壽命蕞大的影響因素就在這里。
氣相色譜柱都會有一個極限溫度,一般使用溫度會在這個極限溫度下的20度左右。通常氣相分析方法是程序升溫的,高溫的溫度和保留時間決定了每一次進樣對色譜柱的影響。不過不同類型的色譜柱因為其填料的性質(zhì)不同,其極限溫度也不同,自然最高使用溫度就不同。反過來說,在相同使用溫度下,其壽命也不相同。
不管什么分析方法都要盡可能的真實反應樣品里的溶劑及所有物質(zhì)的含量, 氣相色譜分析樣品的首要條件是,樣品要能被氣化,就是進樣口溫度及程序終溫要大于樣品的沸點(這也不是絕對的),當樣品中有高沸點的物質(zhì),甚至是無機鹽、機械雜質(zhì),不能被氣化留在了襯管里,甚至留在了色譜柱中,就會對色譜柱有損傷。
這種情況蕞好是要處理一下樣品,萃取、蒸餾、過濾都是常用的方法。如果實在無法避免,就要經(jīng)常更換隔墊、襯管玻璃毛等,過一定時間還要把色譜柱前段割一段下來,通常是1米左右。除了這些,還應注意對樣品性質(zhì)的了解,如果樣品的熱穩(wěn)定性差,進樣分析過程中發(fā)生了分解或者聚合,產(chǎn)生高沸物就會對色譜柱產(chǎn)生很大影響,如果這些物質(zhì)不能被溶劑沖洗的話,這種損傷就是不可逆的,而且分析結(jié)果也不準確。
這種情況下就要適當?shù)慕档蜏囟龋钡讲话l(fā)生這種反應。或者換其它的分析方法。
通常我們使用的載氣是高純氮氣,原因就兩個字——便宜!
但是,排除經(jīng)濟因素,這并不是一個最佳的選擇。因為氮氣的生產(chǎn)就是液態(tài)空氣蒸發(fā)來的,但是因為氮氣和氧氣性質(zhì)接近,一般很難杜絕高純氮氣里含有少量的氧氣。氧氣在高溫柱對整個氣相色譜系統(tǒng)包括色譜柱都會產(chǎn)生不良影響。
所以一般儀器廠家還是建議使用高純氦,尤其在進行計量、驗證等高標準分析時,不過一瓶高純氦可以換5瓶高純氮,一般用戶還是選擇使用高純氮氣。其實從儀器性能來講,也可以使用高純氫氣作為載氣,低含氧量、低背景、低廉的價格都是不錯的選擇,當然一般考慮到氫氣的泄漏以及儲運的風險,往往被用戶所排除。不過,帶TCD檢測器的氣相色譜往往還是使用高純氫氣作為載氣。